RIG-I 信号通路

RIG-I 配体

• 5’ppp-dsRNA

5’ppp-dsRNA 是一种5’三磷酸双链RNA，通过一个由19个核酸分子通过磷酸二酯键聚合成的5`三磷酸单链RNA和其非三磷酸互补链杂交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通过筛选各种序列突变体确定。未加帽的5’三磷酸双链RNA能够被RIG-I特异性识别。

• 3p-hpRNA

3p-hpRNA是通过体外转录甲型流感病毒（H1N1）序列而产生的5’三磷酸发夹RNA。这个有87个核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和双链片段，它们是RIG-I识别的特征结构。3p-hpRNA是RIG-I的一种有效并特异性的激动剂。

RIG-I/MAVS 报告基因细胞

InvivoGen欣博盛生物提供一系基于人源肺癌细胞株A549，小鼠巨噬细胞RAW和人源胚肾细胞HEK293稳转细胞系，助力RNA感受器RIG-I信号通路的研究。这些细胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除细胞株（衍生自A549或RAW细胞系）或者RIG-I基因的过表达细胞株（衍生自HEK-293细胞系）。

描述

所有的RIG-I/MAVS报告基因细胞系均表达一个含有分泌型荧光素酶基因ISG（干扰素刺激基因）诱导型构件。活化RIG-I/MAVS信号通路可诱导ISG启动子的活化并产生荧光素酶，该酶存在于细胞上清并能够通过荧光素酶检测试剂QUANTI-Luc™检测定量。源于A549的细胞携带一个额外的NF-κB诱导表达分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因构件，该酶的活性能够通过SEAP检测试剂QUANTI-Blue™检测定量。

这些RIG-I/MAVS报告基因细胞株携带Zeocin™单抗性基因或Zeocin™和Blasticidin（参见最后一页）双抗性基因。

结果

使 用 RIG-I激动剂，复合了 LyoVec™的 5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual™和RAW-Lucia™ ISG细胞系，ISG应答显著。在A549-Dual™细胞中3p-hpRNA激动性强度明显高于5’pppdsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA复合物活化信号已明显高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的复合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO细胞株中应答消失。使用RIG-I配体刺激HEK-Lucia™对照细胞时ISG反应很弱。而在HEK-Lucia™ RIG-I细胞中，由于RIG-I基因的组成型过表达导致这种应答尤为强烈。同样，当使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA时观察到更高水平的ISG应答。在衍生自A549的细胞株中NF-κB对于RIG-I配体的反应跟ISG应答是相似的，虽然前者更弱一些（参考网站数据）。

ISG对RIG-I配体的反应：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的细胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的细胞。经过孵育过夜，可使用QUANTI-Luc™检测上清中Lucia荧光素酶活性的相对光单位（RLUs）以测试ISG的反应。

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