技术文章您现在的位置:首页 > 技术文章 > Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

Funakoshi欣博盛生物:FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

更新时间:2024-04-17   点击次数:102次

Funakoshi品牌的FAOBlue是一款可通过荧光成像将活细胞内脂肪酸β-氧化(FAO)活性可视化的试剂。只需将产品添加到培养基中,即可通过荧光观察定量脂肪酸β-氧化活性。


FAO(脂肪酸β-氧化,Fatty acid beta-oxidation)

脂肪酸(FA)是多种脂质的基本成分,是细胞的重要组成部分,同时也是能量的主要来源之一。FA降解的主要途径是通过线粒体脂肪酸β-氧化(FAO)。FAO 是肝脏、心脏和骨骼肌等器官能量平衡的关键代谢途径。

FAO是一个复杂的生化过程,涉及多种酶的参与。FAO主要分为以下四个步骤:

1) 脱氢:脂酰-CoA 被酰基CoA脱氢酶氧化成烯酰基-CoA;

2) 水合:烯酰-CoA-被烯酰-CoA水合酶合成-3-羟基乙酰-CoA;

3) 氧化:3-羟基乙酰-CoA转化为 3-酮酰-CoA;

4) 硫解:3-酮酰-CoA转化为酰基-CoA(Cn-2)和乙酰-CoA。乙酰-CoA进一步转化为ATP。生成的酰基-CoA(Cn-2)进入另一个FAO循环,进一步生成酰基-CoA(Cn-4)。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

研究表明,FAO代谢异常与肥胖和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)等多种疾病密切相关,因此检测FAO活性对于诊断相关疾病至关重要。但由于FAO过程较为复杂,使得在活细胞中检测FAO活性的方法非常有限。目前只有一些间接方法,如使用含放射性同位素的脂肪酸或测量耗氧量。

FAOBlue作为首-款直接测量活细胞中FAO活性的试剂,只需在培养基中加入FAOBlue,即可通过荧光成像,简单地检测出活细胞中FAO的活性。

  

FAOBlue原理

FAOBlue是一种具有被乙酰氧甲基酯保护的壬酸(C9)的香-豆-素染料。在被FAO代谢之前,FAOBlue在405 nm下不会激发荧光。FAOBlue的乙酰氧基甲酯可被细胞内的酯酶水解,使FAOBlue可直接穿透细胞膜进入细胞,转化为游离脂肪酸(Free FA type);Free FA type会转化为Acyl-CoA,并进入FAO循环;Acyl-CoA 经过3次FAO循环分解为含有丙酸(C3)的非荧光香-豆-素。经过第4次FAO循环后,香-豆-素染料从丙酸中释放出来并扩散到整个细胞。此时整个细胞内的香-豆-素在405 nm下发出强烈的蓝色荧光,可视化地定量检测细胞中FAO的活性。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂


产品信息

产品货号

产品名称

规格

分子式

分子量

溶解性

FDV-0033

FAOBlue (Fatty Acid Oxidation Detection Reagent)  /欣博盛生物

0.2 mg

C24H31NO9

477.51 g/mol

可溶于DMSO


产品特点

操作简单,加入培养基后,孵育30-120min即可观察荧光;

实例验证适用于多种细胞类型。

 

产品应用

FAO活性的相对定量

评估药物对FAO活性的影响

 

实验步骤

1、在新鲜的HEPES缓冲液(HBS)中加入FAOBlue(最终浓度为5-20μM);

注:可用无血清培养基代替HBS

2、去除培养基,用HBS清洗细胞2次;

3、向细胞中加入含FAOBlue的HBS;

4、在37℃下培养30 min以上;

注:不同细胞类型最佳培养时间有所不同,建议根据具体情况而定。

5、用HBS清洗细胞;

6、通过成像观察活细胞中的蓝色荧光(Ex. 405 nm/Em. 430~480 nm)。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

成像指南

激光共聚焦显微镜:使用显微镜中配备的405 nm激光

落射荧光显微镜:激发滤光片非常重要,建议使用波长为 390-450 nm的激发滤光片


应用实例

一、FAOBlue及其香-豆-素衍生物的吸收光谱和荧光光谱

在PBS缓冲液(pH 7.4)中,FAO代谢后释放的FAOBlue和香-豆-素衍生物的吸收光谱(左)、荧光光谱(右)。

FAOBlue经过FAO转化为香-豆-素衍生物后,吸收峰从FAOBlue发生偏移至405 nm。因此,在405 nm的激发条件下,FAOBlue不会发出荧光,只有在通过FAO释放香-豆-素衍生物时才会发出蓝色荧光。

注:FAOBlue在300-380 nm(最大350 nm)激发时显示蓝色荧光(灰色线,370-450 nm),所以在选择滤光片时请格外注意,避免同时激发未反应的FAOBlue以及FAO反应后的香-豆-素衍生物。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂


二、各种癌细胞中FAO活性可视化

在4种癌细胞中加入FAOBlue,培养一定时间后进行荧光观察。所有细胞都出现蓝色荧光,而经过FAO抑制剂etomoxir处理后蓝色荧光显著减少。这些数据表明,蓝色荧光是由活细胞中FAO活性引起的。(注:实验条件根据细胞类型不同而不同)

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

HepG2 : 5 μM, 30 min、 LNCaP: 20 μM, 120 min、HeLa : 20 μM, 120 min、A549 : 5 μM, 30 min


三、药物对FAO活性的干扰

对HepG2细胞分别进行AICAR(通过 AMPK 激活的 FAO 激活剂)和ranolazine(部分 FAO 抑制剂)处理,随后加入FAOBlue(5uM)孵育30分钟。结果显示,与对照细胞(未处理)相比,AICAR处理后明显增加蓝色荧光强度,ranolazine处理后则明显降低蓝色荧光强度。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂


四、药物对FAO活性影响的定量分析

将HepG2细胞与不同浓度的ND630预孵育4小时。ND630处理后,加入FAOBlue(5uM)孵育30分钟。结果表明,伴随ND630浓度增加,蓝色荧光强度随之增加。由此可知,ND630可增强FAO活性。(注:ND630是乙酰-CoA羧化酶抑制剂,被认为是治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的潜在药物)

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

五、NASH模型小鼠的FAO活性分析

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种与脂质相关的疾病,表现为脂肪酸代谢活性低。向正常小鼠和NASH模型小鼠以口服形式给药增强脂质代谢的bezafibrate后,提取原代肝细胞。向各组细胞加入FAOBlue(5 μM)观察其FAO活性,结果显示,相较正常小鼠来源细胞,NASH模型小鼠来源细胞的FAO活性明显被抑制。另外,给药bezafibrate的NASH模型小鼠来源细胞中FAO活性被恢复。

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

产品文献

Uchinomiya et al., Chem. Commun., 56, 3023-3026 (2020) Fluorescence Detection of Metabolic Activity of Fatty Acid Beta Oxidation Activity in Living Cells.

 

 

FAOBlue---脂肪酸β-氧化(FAO)活性荧光定量试剂

更多详情可联系Funakoshi中国代理商-欣博盛生物