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蛋白质印迹(Western Blot) 保姆级教程 Part1:实验方案

更新时间:2024-08-09   点击次数:155次

蛋白质印迹(Western Blot)保姆级教程

Part1:实验方案

 

蛋白质免疫印迹(Western Blot)是利用抗原与抗体特异性结合的特点,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白。

 

我们的Western Blot实验方案包含蛋白提取、电泳、转膜、封闭、孵育抗体、检测(图1)及所涉及的试剂,为您的WB实验保驾护航。


蛋白质印迹(Western Blot) 保姆级教程  Part1:实验方案

图1、Western Blot实验步骤


● 蛋白提取

1、使用Trident Extraction Kits从样本(细胞或组织)中提取蛋白。

(注:根据蛋白与抗体的具体情况优化细胞数量以及上样量)

2、蛋白浓度定量,在-20℃或更低温度下冷冻保存。

3、在样品中加入Trident Sample Buffer,100℃煮沸5mins,使蛋白质变性;瞬时离心上样。

(注:必要时,使用前在Trident Sample Buffer加入二硫苏糖醇(DTT)或/3-巯基乙醇(2-ME))

 

● 相关产品

货号

名称

规格

GTX400005

Trident RIPA Lysis Buffer

100ml

GTX400033

Trident RIPA Lysis Buffer (Low SOS)

250ml

GTX00835

Trident High-Efficiency Exosome Precipitation Reagent

20ml

GTX16357

Trident 6x Laemmli SOS Sample Buffer

25ml

 

● SDS-PAGE电泳、转膜

1、将30 µg蛋白或 100 ng纯化蛋白装入SDS-PAGE凝胶孔中。

在SDS-PAGE凝胶孔中加入适量的Trident Blue Prestained Protein Ladder (GTX16376) 或 Trident Prestained Protein Ladder(高范围:GTX50875 或标准范围:GTX49384)装入1个或多个额外的泳道中。

2、使用1x Running buffer以50-100 V的电压运行1-2小时。建议将电压调低并延长时间。可使条带更清晰,分辨率更高。

3、在Transfer buffer中将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或甲醇漂洗过的PVDF膜上。

(可选:在进行下一步之前,通过 Ponceau Red染色确认蛋白质转移成功)

 

● 相关产品

货号

名称

规格

GTX16370

Trident 20% SOS (w/v)

500ml

GTX50875

Trident Prestained Protein Ladder (High Range)

500µI

GTX49384

Trident Prestained Protein Ladder (Standard Range)

500µI

GTX16376

Trident Blue Prestained Protein Ladder

500µI

 

蛋白质印迹(Western Blot) 保姆级教程  Part1:实验方案

 

● 封闭、孵育抗体、洗膜

1. 封闭:在3%脱脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中封闭30-60分钟。

2. 一抗孵育:将膜置于含适当稀释一抗的1%脱脂牛奶/PBST或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中,在RT下孵育两小时或在4°C下过夜。

3. 洗膜:1x PBST ,一次10分钟,两次5分钟。

4. 二抗孵育:将膜置于含适当稀释二抗的1%脱脂奶/PBST 或Trident Universal Protein Blocking Reagent(GTX30963)中孵育1小时。

5. 洗膜:1x PBST ,三次,每次10分钟。

(注:Trident Universal Protein Blocking Reagent不含任何动物血清,适用于WB、ELISA、IHC和ICC/IF实验)

 

● 相关产品


货号

名称

规格

GTX30963

Trident Universal Protein Blocking Reagent (animal serum-free)

100ml

GTX30977

Trident 10x PBST

100ml

GTX30976

Trident 10x TBST

100ml

GTX213110-01

Goat Anti-Rabbit lgG antibody (HRP)

1ml

GTX213111-01

Goat Anti-Mouse lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224125-01

Rabbit Anti-Rat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX224126-01

Rabbit Anti-Chicken lgY antibody (HRP)

1ml

GTX232040-01

Donkey Anti-Goat lgG antibody (HRP)

1ml

GTX221666-01

EasyBlot anti Rabbit lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX221667-01

EasyBlot anti Mouse lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628474-01

EasyBlot anti Rat lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628547-01

EasyBlot anti Goat lgG (HRP)

250µI , 50µI

GTX628906-01

EasyBlot anti Sheep lgG (HRP)

250µI , 50µI



 蛋白质印迹(Western Blot) 保姆级教程  Part1:实验方案 

 

● 基于ECL成像

按照Trident plus Western HRP Substrate(GTX400006)或Trident femto Western HRP Substrate(GTX14698)来检测信号。


货号

名称

规格

GTX400006

Trident plus Western HRP Substrate

500ml

GTX17435

Trident pico Western HRP Substrate

100/500ml

GTX14698

Trident femto Western HRP Substrate

100/200ml

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