Cosmo Bio PUREfrex®系列无细胞蛋白合成试剂盒原理及特点

PUREfrex®是一系列重组无细胞蛋白质合成试剂，重组系统只与转录、翻译相关因素有关，使用者可以根据需要来自由调整反应混合物的成分，由于它只含有已知的蛋白质和底物，因此在下游应用中不必考虑高背景的影响。

什么是PURE？

PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系统技术是由东京大学的Takuya Ueda教授发明的重组无细胞蛋白质合成系统。

该反应系统仅由蛋白质、核糖体、氨基酸和NTPs组成。这些蛋白质是转录、翻译、氨酰化和能量再生所必需的。所有的蛋白因子和核糖体都是单独高度纯化的，并在缓冲液中与底物如氨基酸、NTPs和tRNAs组装。翻译因子包括: 起始因子IF1/IF2/IF3，延伸因子EF-Tu/EF-Ts/EF-G，释放因子RF1/RF2/RF3，核糖体再循环因子(RRF)，20种氨酰tRNA合成酶(ARS)，甲硫氨酰tRNA转移酶。

图1. PURE(Protein synthesis Using Recombinant Elements)系统技术示意图

该系统是仅由转录和翻译系统组成的，不像其他使用细胞裂解物的无细胞蛋白质合成系统。该系统没有未知蛋白质，成分可以随客户需要调整。

什么是PUREfrex？

PUREfrex是基于PURE系统技术的产品，该试剂盒主要由3种试剂组成。溶液I包含氨基酸、NTPs、其他小分子化合物和tRNAs。溶液II包含RNA聚合酶、翻译因子和其他蛋白质。溶液III含有纯化的核糖体。将纯化的组分以达到最大蛋白质合成活性的浓度混合。对于蛋白质合成，将编码自己感兴趣的蛋白质的DNA(或mRNA)加入到溶液I、II和III的混合物中，然后孵育反应混合物。PUREfrex减少了与蛋白质合成无关的污染物。例如，来自大肠杆菌的脂多糖减少到每ul反应混合物约0.1 EU。核糖核酸酶、β-半乳糖苷酶和其他污染蛋白的量也减少了。PUREfrex试剂中包含的所有翻译因子和其他蛋白质不包含任何标签序列。这使得可以使用任何标签序列来纯化和检测合成的蛋白质。

图2. PUREfrex与原始PURE系统中污染物比较

PUREfrex®试剂盒总共有3个系列：PUREfrex®1.0；PUREfrex®2.0；PUREfrex®2.1。

PUREfrex®1.0

2011年推出，反应溶液的成分信息是公开的，适用于产品定制等需要明确组成成分信息的研究。虽然使用 PUREfrex® 2.0 合成蛋白时的速度较快，但可能无法及时形成和折叠二硫键等导致不溶，此时使用合成速度较慢的PUREfrex® 1.0 效果可能更好。

PUREfrex®2.0

2015年推出，PUREfrex® 2.0改进了从大肠杆菌中纯化的所有组分的制备方法，并优化了因子的组成，使PUREfrex 2.0实现了比PUREfrex 1.0高2-10倍的蛋白质生产率。适用于需要合成大量蛋白及多种蛋白的研究。反应液成分信息保密。

PUREfrex®2.1

于2017年推出，在保留PUREfrex® 2.0 反应液组成的基础上，单独添加了还原剂，因此可根据添加的还原剂（和氧化剂）种类和数量来调整合成过程中的氧化还原状态。适用于需严格控制氧化还原状态的含二硫键结合的蛋白合成。

图3.PUREfrex® 1.0和PUREfrex® 2.0对比数据

图4.PUREfrex®2.0和PUREfrex®2.1成分对比

产品信息

应用

使用PUREfrex®可合成各种活性蛋白，包括原核蛋白、真核蛋白、膜蛋白、含二硫键的蛋白质、含非天然氨基酸的蛋白质。PUREfrex®可用于以下研究领域，适用于各种蛋白质的小规模、高通量合成，也是蛋白质功能评估的机器学习平台的理想选择。

1. 核糖体展示技术

2. mRNA展示技术

3. 蛋白翻译机制研究

4. 蛋白质合成后的折叠

蛋白合成添加剂

根据您的蛋白质的性质，可以选择不同的添加剂，添加到PUREfrex®试剂盒中，改善蛋白的折叠和溶解性。

1.分子伴侣

分子伴侣像hsp70（如E. coli DnaK）有助于合成蛋白质的正确折叠。由于PUREfrex®试剂盒不含任何分子伴侣，一些蛋白质可能难以形成正确的构象，合成后为不溶性。在这种情况下，添加分子伴侣可能有助于增加溶解性和活性。

2.形成二硫键

对于某些蛋白质，如分泌蛋白，二硫键的形成对其稳定性或活性很重要。二硫键通常是由相邻半胱氨酸残基的巯基（SH-）氧化形成的。因此，氧化环境是形成二硫键所必需的。此外，二硫键异构酶（如E. coli DsbC）可以催化二硫键交换，也是形成半胱氨酸正确配对所必需的。

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