凝集素应用手册之Western Blotting- 多色荧光法

通过将荧光技术引入Western Blotting这一检测平台，实现了在同一张膜上同时使用多个探针，这样就有机会准确量化和比较每个相关条带的所有信号。如果某种凝集素与蛋白质条带结合（共定位），则可精确检测出蛋白质的糖基化状态。第14篇参考文献中的一张图表则是一个利用荧光技术鉴别 IgG Fc 片段与 Fab 片段糖基化状态的很好例子，下面的实验流程简要介绍了这种方法。

 精选文献 

• Whole sample protein glycosylation analysis (Ref. 47)

• Determine glycosylation of specific protein(s) (Ref. 30)

• Track glycosylation changes across physiological events (Ref. 28)

 实验流程概览 

样本制备

• 按照实验室常规Western Blotting流程制备样本；

• 电泳、转膜（建议使用PVDF膜，可以减少背景）。

封闭

• 使用Vectorlabs的CFB溶液(Carbo-Free™ Blocking,SP-5040-125),室温孵育膜30-60分钟。或4℃过夜孵育。

检测

• 加入荧光标记的凝集素(根据需求，亦可选择使用生物素标记的凝集素),室温孵育一小时或者4℃过夜孵育；建议凝集素的初始工作浓度为0.5–10ug/ml。具体凝集素的孵育条件和使用浓度需要用户进行优化；

• TBST室温洗膜 5–10 分钟，4次；

• 加入其他感兴趣的荧光标记的试剂（一抗或其他凝集素）室温孵育一小时，或4℃过夜孵育。

显色

• 如果使用了生物素标记的凝集素，此步骤需要加入荧光标记的链霉亲和素或亲和素孵育1小时；

• TBST室温摇动洗膜 5–10 分钟，2次。

信号收集

• 将膜进行干燥处理；

• 图像采集。

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