Alpha-突触核蛋白操作指南(2)—细胞检测 (Cell Culture)

更新时间：2026-02-13 点击次数：27次

细胞检测 (Cell Culture).png

以下步骤是使用1型和2型alpha突触核蛋白前体纤维原(PFFs)处理神经元，然后获取ICC图片的实验指南。1型alpha突触核蛋白PFFs处理的原代大鼠海马体神经元显示了路易体的内含形成，而经2型alpha突触核蛋白处理的神经元没有路易体形成。

● 海马体神经元取自出生一天的Sprague Dawley大鼠幼鼠，然后接种在多聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的孔板上，每孔80,000个细胞。

● 前体纤维原在水浴超声波仪中处理1小时，然后马上进行神经元处理。

● 神经元用4µg/mL 的前体纤维原处理。对照孔中只有转移媒介不含alpha突触核蛋白。

● 所有板孔7天后经过一个50% 基液变化。

● 基液变化7天之后（离体处理14天后），所有板孔用4%甲醛固定20分钟。

● 用过滤过的10mM PBS洗掉甲醛，洗三次(每次10分钟)。

● 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (LiCOR, 927-40010)和30mL/mL的0.1% triton-X 100固定细胞30分钟。

● 30分钟之后, 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含30mL/mL的 0.1% triton-X 100) 稀释一抗，并加入到板孔中，4℃下过夜孵育。

● 第二天, 用过滤过的10mM PBS洗掉一抗溶液，洗三次(每次10分钟)。

● 用1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block (含30mL/mL的0.1% triton-X100) 稀释二抗，然后加入到板孔里黑暗中孵育60分钟。

● 60分钟过后, 用过滤过的10mM PBS洗掉二抗溶液，洗三次 (每次10分钟).

● 用落射荧光显微镜 (Olympus IX73, B&B显微镜) 20X目镜观察孔板拍照.

● 所有图片都是在相同的比例和曝光时间下拍取的

一抗：抗-pSer129

复染色：Hoechst reagent

复染色稀释度：1:3000

复染色孵育时间：1hr

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原代大鼠海马体神经元被1型突触核蛋白前体原纤维(SPR-322)4µg/ml(D-F)处理后显示路易体内含物的形成，而当被2型突触核蛋白前体原纤维(SPR-317)4µg/ml(A-C)处理时没有路易体内含物形成.

组织：原代海马体神经元.

物种：斯普拉-道来氏大鼠.

固定：由PFA制作的4% 甲醛.

一抗：小鼠抗pSer129抗体, 稀释度 1:1000, 4°C下处理24小时.

二抗：FITC羊抗小鼠(绿色) 稀释度 1:700室温下孵育1小时.

复染色：Hoechst(蓝色)细胞核染色, 1:4000室温下孵育1小时.

细胞定位：路易体内含物.

放大倍数：20x.

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原代大鼠海马体神经元(DIV16)被1型小鼠α-突触核蛋白前体原纤维(SPR-324)4µg/ml(D-F)处理后显示路易体内含物的形成以及细胞减少，而当被对照突触核蛋白前体原纤维(A-C)处理时没有路易体内含物形成及细胞减少.

组织：原代海马体神经元.

物种：斯普拉-道来氏大鼠. 固定：由PFA制作的3%甲醛固定20分钟.

阻断：1:1 PBS:LiCOR Odyssey Block(LiCOR, 927-40010)以及30mL/mL, 0.1% triton-X 100 阻断30分钟.

一抗：小鼠抗pSer129 抗体 (1:1000), 以及兔抗pSer129 (1:800), 4°C下处理24 小时.

二抗：ATTO 546 驴抗小鼠 (1:700)和ATTO 488驴抗兔 (1:700)室温下孵育一小时(复合图绿色).

复染色：Hoechst (蓝色) 细胞核染色, 1:3000 室温下孵育1小时.

细胞定位：路易体内含物. 放大倍数: 20x.

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